Un método fundamental para estudiar las bacterias es cultivarlas en un medio líquido o en la superficie de un medio sólido de agar. Los medios de cultivo contienen distintos nutrientes que van, desde azúcares simples hasta sustancias complejas como la sangre o el extracto de caldo de carne.
Para aislar o purificar una especie bacteriana a partir de una muestra formada por muchos tipos de bacterias, se siembra en un medio de cultivo sólido donde las células que se multiplican no cambian de localización; tras muchos ciclos reproductivos, cada bacteria individual genera por escisión binaria una colonia macroscópica compuesta por decenas de millones de células similares a la original. Si esta colonia individual se siembra a su vez en un nuevo medio crecerá como cultivo puro de un solo tipo de bacteria. Muchas especies bacterianas son tan parecidas morfológicamente que es imposible diferenciarlas sólo con el uso del microscopio; en este caso, para identificar cada tipo de bacteria, se estudian sus características bioquímicas sembrándolas en medios de cultivo especiales. Así, algunos medios contienen un producto que inhibe el crecimiento de la mayoría de las especies bacterianas, pero no la de un tipo que deseamos averiguar si está presente.
Otras veces el medio de cultivo contiene determinados azúcares especiales que sólo pueden utilizar algunas bacterias. En algunos medios se añaden indicadores de pH que cambian de color cuando uno de los nutrientes del medio es fermentado y se generan catabolitos ácidos. Si las bacterias son capaces de producir fermentación, generan gases que pueden ser apreciados cuando el cultivo se realiza en un tubo cerrado.
Con otros medios de cultivo se identifica si las bacterias producen determinadas enzimas que digieren los nutrientes: así, algunas bacterias con enzimas hemolíticas (capaces de romper los glóbulos rojos) producen hemólisis y cambios apreciables macroscópicamente en las placas de agar-sangre. Los diferentes medios y técnicas de cultivo son esenciales en el laboratorio de microbiología de un hospital, pues sirven para identificar las bacterias causantes de las enfermedades infecciosas y los antibióticos a los que son sensibles esas bacterias.
Los requerimientos necesarios para un cultivo de bacterias son:
- Medio de carbono.
- Presencia o ausencia de oxigeno.
- Atmósfera adecuada.
- Agar-agar.
Para un cultivo adecuado de bacterias y microorganismos, se utiliza el agar, un gel coloidal formado por hidratos de carbono, de extendido uso comercial, y que proviene de las paredes celulares de varias especies de algas rojas, en concreto de miembros orientales del género Gelidium. Se utiliza como agente solidificante en la preparación de dulces, cremas y lociones, así como en las conservas de pescado y carne; para texturizar y emulsionar los helados y postres congelados; para clarificar, durante el proceso de fabricación del vino y la elaboración de la cerveza; y también para dar apresto (almidonar) las telas. Además, es un excelente medio de cultivo de bacterias, ya que no se disuelve por el efecto de las sales, ni se consume por la acción de la mayoría de los microorganismos.
El agar se extrae de las algas marinas haciéndolas hervir. Posteriormente, el producto resultante se deja enfriar y secar, y al final se solidifica en pastillas o en escamas. En un principio se llamó agar-agar, un término que se utiliza en Malasia para denominar a un alga local.
- Existen diferentes tipos de medio de cultivos de acuerdo a las especificidades que cada uno tenga, sin embargo cada tipo debe de cumplir con los requerimientos:
Fuente de energía.- Las bacterias pueden ser fotótrofas o quimiotótrofas. Las fototótrofas absorben energía del sol y las quimiotótrofas de compuestos orgánicos.
Fuente de carbono.
Fuente de nitrógeno.- Las bacterias pueden obtener el nitrógeno atmosférico a través de las proteínas o por la degradación de aminoácidos o péptidos.
Azufre y fosfatos.- La obtienen como elemento(S), y como fosfatos en sales (P).
Vitaminas.
Agua.- Medio de transporte que permite una mejor absorción de los nutrimentos.
- También requiere de los requerimientos nutricionales óptimos para su desarrollo:
Proteínas.- Se suministran generalmente peptonas, que se encuentran disponibles en el comercio, preparadas por digestión parcial de carne con enzimas peptídicas; consisten en polipéptidos, dipéptidos y aminoácidos.
Carbohidratos.- Sumistran carbono para la síntesis, y además su fermentación libera energía utilizable en el metabolismo.
Factores accesorios de crecimiento.- Son también requerimientos por algunas bacterias. Entre ellos están las vitaminas del complejo B; estas suministran enzimas necesarias para que las bacterias que son incapaces de sintetizar otros factores necesarios para algunas bacterias son obtenidos de los nutrimentos más complejos.
Sales minerales.- Elementos como K, Ca, Na, etc.; también son requeridas por algunas bacterias en su desarrollo.
Atmósfera.- Algunos microorganismos precisan oxígeno para su desarrollo, otros son incapaces de reproducirse en presencia de este elemento, en cambio otros organismos pueden crecer en una atmósfera con oxígeno, logran sobrevivir y crecer sin el, se les llama anaerobios facultativos.
Presión osmótica.- Las células pueden encogerse y ser destruidas en soluciones hipertónicas; inversamente se rompen por entrada de agua, en las soluciones hipotónicas.
Temperatura.- La temperatura para la cual los organismos microbianos crecen mejor, es considerada como temperatura óptima.
Luz.- La mayoría de las bacterias se desarrollan mejor en ausencia de luz. La luz ultravioleta puede ser letal.
Reacción.- La mayoría de las bacterias crece en un medio ligeramente alcalino (pH 7.2 a 7.6). Los hongos crecen con facilidad en los medios ácidos (pH 5).
Actualmente existen diferentes formas y métodos de cultivar en el mercado, ya que pueden cultivarse en placas, tubos etc.
Método de placas.- El propósito de usar medios sólidos pulverizados en cajas petris, consiste en inocular cantidades sucesivas menores de material en el medio, de manera que en algún tiempo sean colocados en una capa tan delgada que les permita el crecimiento de colonias individuales aisladas.
Medios inclinados.- Este tipo de cultivo es empleado principalmente para resembrar cepas aisladas, sea para identificación interior o para base cultivo.
Cultivos por agitación.- Este medio de cultivo es empleado particularmente en el aislamiento de anaerobios esporulado. Se calienta un tubo o botella a 50°C y luego se deja enfriar.
Cultivos por picadura.- En este método el material de laboratorio es colocado en un alambre recto e introducido al medio. El método puede ser también empleado para conservar los cultivos patrón.
Cultivos líquidos.- Al inocular en un medio líquido como el agua con peptona o el caldo con tioglicolato, el tubo se inclina y el material se extrae del asa por frotamiento contra la pared del tubo.
- De acuerdo a las especifidades de cada medio pueden clasificarse segun su :
A.- Medios líquidos
B.- Medios sólidos: llevan un agente solidificante (Agar) que es un polisacárido acídico producido por ciertas algas rojas que gelifica por debajo de 45° C. Se usa a una concentración del 1,5%.
C.- Medios semisólidos: agar a una concentración del 0,7%.
B.- Medios sólidos: llevan un agente solidificante (Agar) que es un polisacárido acídico producido por ciertas algas rojas que gelifica por debajo de 45° C. Se usa a una concentración del 1,5%.
C.- Medios semisólidos: agar a una concentración del 0,7%.
2.- Composición:
A.- Medios sintéticos o químicamente definidos. Llevan fuente de carbono, fuente de nitrógeno, sales que suplan iones (P, K, Mg, Fe, Ca...), otros elementos como son estimuladores del crecimiento (eritritol para Brucella abortus) pero siempre a concentraciones conocidas.
B.- Medios complejos o de composición indefinida. Estos medios llevan ingredientes como extracto de levadura, peptona, infusión de cerebro, extracto de carne, etc. que contienen nutrientes en abundancia pero sin saber con exactitud la composición cualitativa ni cuantitativa de estos nutrientes.
C.- Medios de enriquecimiento. Son medios complejos (normalmente) con aditivos adicionales para favorecer el crecimiento de determinados microorganismos (particularmente heterótrofos exigentes). Ejemplo: adicción de sangre, suero o extractos de tejidos de animales y plantas.
D.- Medios selectivos. Son aquellos que favorecen por su diseño el crecimiento específico de un microorganismo particular (o grupo de microorganismos). Es de gran utilidad para el aislamiento de microorganismos a partir de una población microbiana mixta. Ejemplo: CO2 como fuente de carbono es selectivo para autotrofos; adiccionando cristal violeta se inhibe el crecimiento de los Gram (+); utilizando maltosa como única fuente de carbono sólo crecerán los que usen maltosa.
E.- Medios diferenciales. Son aquellos destinados a facilitar la discriminación de microorganismos de una mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en dichos medios. Ejemplo: Agar sangre diferencia hemolíticos de no hemolíticos; McConkey diferencia lactosa (+) de lactosa (-).
F.- Medios de mantenimiento. Suelen ser distintos a los de crecimiento óptimo ya que el crecimiento rápido y prolífico suele ocasionar la muerte rápida de las células. Ejemplo: al añadir glucosa y utilizarla los microorganismos producen ácidos, acidificándose el medio por lo que es preferible no utilizar glucosa en los medios de mantenimiento.
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