Tinciones

Fany B. |

Las tinciones se usan para tres cosas fundamentalmente:

• Descripción de microorganismos en base a su morfología, estructura y distribución.
• Detección de determinados microorganismos para diagnostico clínico, por ejemplo.
• Clasificación de microorganismos según sus características tintoriales.

Tipos de colorantes:

• Ácidos:
• En disolución se cargan negativamente por eso se unen a estructuras cargadas positivamente y no las células, que tienen carga negativa.
• Sales de Na. K, Ca, ión amonio, eosina, rojo congo, rosa bengala, fucsina ácida...

• Básicos:
• En disolución se cargan positivamente uniéndose a estructuras con carga negativa como las células.
• Cloruros, sulfatos, azul de metileno, cristal violeta, verde malaquita, fucsina fenicada o carbol-fucsina...

Características de un cultivo para una buena tinción:

• Ha de estar en fase exponencial de crecimiento y no ser viejo.
• Debe haberse obtenido de un cultivo sólido, para tinciones simples puede ser necesario usar un cultivo liquido.

Preparación de un frotis:

• Suspensión de una colonia de un cultivo puro en una gota de agua
• Extensión de la gota en un porta, con ayuda de otro porta, en la parte central del primero.
• Secado al aire.
• Fijación a la llama para deshidratar la muestra. Se hace pasando tres veces el porta por la llama rápidamente.

Tipos de tinciones:

• Simples: se usa un solo colorante disuelto en solución acuosa o alcohólica, y se suplementan con un mordiente para una mejor fijación del colorante además de aumentar el grosor de algunas estructuras para su mejor visión. Sirven para ver la morfología y las agrupaciones que forman los microorganismos entre ellos y con otras células.
• Diferenciales:Se usa mas de un colorante. Tiñe de diferente modo a las células de distintas especies.

TINCIÓN DE GRAM

Es la más importante en bacteriología. Gracias a ella distinguimos dos tipos de bactrias:

- Gram +. Son aquellas que se tiñen con cristal violeta (colorante primario)

- Gram -. Son aquellas que se tiñen con safranina (colorante secundario)

Protocolo:

1. Frotis

2. Fijación

3. Cristal violeta (2 minutos)

4. Lugol (un minuto). Es un mordiente que aumenta la afinidad de la célula por el colorante anterior.

5. Alcohol 96º o acetona. Decolora la preparación. 45 segundos.

6. Lavar con agua

7. Safranina (un minuto)

8. Lavar con agua, secar y observar

Las gram + aparecerán violetas, y las gram – aparecerán rosas. Las diferencias entre + y – obedecen a la estructura de su pared celular:

Las gram + tienen una pared muy gruesa que contiene muy pocos lípidos, mientras que las gram – son muy delgadas y contienen gran cantidad de lípidos.

Con el cristal violeta, tanto las + como las – se tiñen de violeta, y con el lugol, retienen el colorante aún más. El alcohol 96º, que es un deshidratante, elimina los lípidos de las células. Las gram + pierden los pocos lípidos que tienen, pero esto no afecta a la permeabilidad de su pared. Las gram -, en cambio, tienen muchos lípidos, así que provoca grandes poros, alterando la permeabilidad. Como consecuencia se elimina el cristal violeta.

Con la safranina, las gram + no s tiñen, porque ya están ligadas al cristal violeta, pero las gram – sí.

La tinción de Gram debe realizarse en cultivos jóvenes de bacterias, ya que presentan paredes normales, mientras que en cultivos viejos, las paredes están degradadas. Una garm + vieja se comportaría como una gram -.

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  TINCIÓN ÁCIDO-ALCOHOL RESISTENTE (Zeihl Neelsen)

Se emplea para poner de manifiesto la existencia de bacterias pertenecientes al gén. Mycobacterium, tales como M. Tuberculosis o M. Leprae, que causan tuberculosis y lepra.

Protocolo:

- Frotis

- Fijación

- Tinción con fuchsina fenicada (colorante primario) con calor durante 5 minutos.

- Decoloración con alcohol ácido.

- Lavar con agua

- Azul de metileno (colorante de contraste) durante un minuto

- Lavar con agua, secar y observar.

Las bacterias pertenecientes al gén. Mycobacterium aparecen coloreadas de fuchsina, resistente a la decoloración con alcohol-ácido. El resto de bacterias aparecen teñidas con el colorante de contraste.

Mycobacterium es ácido-alcohol resistente porque contiene, en su pared celular, ácidos micólicos, que son un tipo de ceras que les confieren gran impermeabilidad, por lo que no toman colorantes. La única manera de que se tiñan es aplicando calor, pero, una vez que ha tomado el colorante, no se decoloran ni con compuestos agresivos como el alcohol-ácido.